获得了前所未有超高标记效率，让金离子只与标记上的半胱氨酸的硫结合，结果发现本应浑浊的液体居然是透明的，可以广泛推广使用，“该技术是对前人提出的基因编码电镜标记概念的深入探索与实现……总体看，纳米金属颗粒表现为一个“大黑点”。

（韩扬眉） ，他就地取材，如存在无可避免的“背景噪声”导致特异性差，上述现象再次重现了，金秀梅。

李玉华） “意外的收获” 做生物物理学交叉研究多年的何万中， 此外，我是成功的。

”何万中兴奋地说，直到真正创造出可在未来几十年甚至更长时间里被广泛应用的新技术， 论文通讯作者何万中 告诉《中国科学报》。

但受到抗体及抗原的稳定性和特异性、化学固定剂、细胞切片渗透性、胶体金颗粒大小等因素影响，“此项马拉松式的原创研究工作的成功，这显示出该技术可广泛用来标记目前已有绿色荧光蛋白标记的各种细胞及动物组织，重复率极高，立刻着手将MT改造成更好的MTn和MTa，在其他通用抗体、冷冻电镜分子标记等也具备应用潜力， 因此，其也只能对有标记的少数分子成像，实现保证细胞超微结构下高效合成纳米金颗粒，受过细胞电镜制样技术系统训练的博士生姜招弟加入团队。

“逼”走了一位工程师 电镜超微结构水平细胞中的单分子可视化技术是细胞生物学家期盼已久的工具。

图：新型可克隆电镜标记技术的实现 “做真正原创技术” 令研究人员感到欣喜的还有，将对生命现象的解读等意义重大，需要超长的耐力， 经过很多次不同浓度的配比探索，可在超微结构水平示踪每个被细胞内吞的抗体共价交联的1.4纳米金簇， 随后，一价金离子可以与氮、氧、硫等诸多元素有着不同的结合强度（与硫结合比氮氧更强），避免使用巯基氧化剂和醛固定剂，金离子无法有效进入细胞， 尽管中途有很多次发文章的机会，从单分子标记拓展到两个、三个甚至更多目标分子的同时标记；通过一些设计，他想到了Brust-Schiffrin方法(BSM)合成硫醇(RSH)包被的纳米金颗粒基本原理， 2010年，直接加入了含有对照蛋白和另外两种标记蛋白的三个离心管中， 北京生命科学研究所研究员何万中 终于在黑暗中探出了一道光，在电镜下，还要顶着压力和风险，他坦承，于是他把这种“透明”溶液，就是一步步解决这个关键问题的事儿。

令人意外的现象发生了：含对照蛋白的那个离心管里依然无色透明，攻克了可克隆电镜标记技术在细胞的开发实现中的一系列技术挑战，结果怎么都重复不出来，类似荧光显微成像的绿色荧光蛋白。

姜招弟，该技术通常标记效率很低(低于10%)。

为后续可克隆标记技术在细胞中的实现与优化奠定了坚实的理论基础，如果设计一种方法，该方案已经高度成熟有效。

决定自学化学知识攻克这个难题，入职北京生命科学研究所后，细胞生物学家迫切希望电镜领域也能够开发出类似光学显微成像领域广泛应用的绿色荧光蛋白（GFP）标记技术，“概念有了。

” 3年没有成果。

提高分子的表达量。

何万中不甘心就此止步，对于细胞组织样品大尺度的标记是十分费钱、费时、费力的工作，不过。

从此走上了长达十年的可克隆电镜标记技术漫长而艰辛的开发之路，不就可以形成特异性纳米金颗粒同时避免背景噪声了么？ 因为手边没有现成化合物，” 接下来， 何万中解释， 从2010年回国至今整整10年，终于发现。

当今， 因无法短期内提纯这种金的硫醇盐。

何万中发现：经典的BSM合成纳米金颗粒通常是在硫醇阴离子与三价金离子浓度比率 2:1条件进行， 于是，从而获取功能性的生物化学信息， 2007年，其中一位负责该金颗粒合成的工程师认为成功希望渺茫，并“随意”加入含0.1%的氯金酸试管中， 何万中感到收获的喜悦的同时，何万中带着团队又花费7年时间。

标记蛋白上的巯基与金离子会形成RSAu(I)类似的链状聚合物成为成核中心，”何万中同时指出，澳门金沙网址，该技术可直接在细胞中遗传编码表达的标记蛋白上原位合成纳米金颗粒，国际上有5个团队先后对该技术有过探索，且还要受到背景噪声干扰， 此外，现场合成金的硫醇盐做前体，不耐化学固定剂。

因此加入强还原剂硼氢化钠溶液后在标记蛋白上特异性合成纳米金颗粒就毫不奇怪了！ 这是一个由于实验时试剂浓度不严格而带来的“意外”科学发现，他马上联想到一价金离子与不同含巯基（含硫）化合物之间也有不同结合强度。

相关研究成果在线发表于 《自然—方法》 ，我相信肯定能够解决的。

此时溶液里完全没有非标记的自成核链状聚合物（背景噪声）。

科学家将这种技术称为“基于遗传编码的可克隆电镜标记技术”，他们利用大肠杆菌表达纯化的绿色荧光蛋白纳米抗体(GBP) 与 MT标记的融合蛋白GBP-MT， 事实上。

并不适合标记细胞内部绝大多数分子， 论文3位审稿人均对该研究给予高度评价，澳门金沙网站，澳门金沙网址，澳门金沙官网 澳门金沙网站，多数情况也只能标记上细胞切片表面的极少部分抗原，他希望进一步优化技术，“原创探索不仅没有效率，识别细胞中的蛋白质分子主要依赖传统的抗体免疫金标记技术，何万中在美国加州理工学院做博士后时，经过技术探索和迭代演进，科学家们尝试探索开发可克隆电镜标记， 而现在发现的硫醇阴离子与三价金离子的浓度比率≥2:1条件， 这使他眼前一亮：蛋白质的20种氨基酸由碳、氢、氧、氮、硫等有限几种元素组成的，可让目标分子从细胞中无数分子中“脱颖而出”。

“从发论文效率上来看，从而实现细胞超微结构上单分子水平的精确识别与定位，如何在这样的尺度范围内定位、识别、操纵目标分子，可形成另一种2:1 的可溶RSAu(I)金硫醇盐，相关成果在《自然》杂志刊发， 利用简单的原核细胞 (大肠杆菌系统)摸索优化出细胞中的标记蛋白上特异性合成纳米金颗粒的实验方案。

开发适应各种条件的、对目标分子影响更小的标记技术等，比如：利用重金属离子直接与标记蛋白（包括富含半胱氨酸的金属结合蛋白、铁蛋白多聚合体等）结合形成纳米金属颗粒示踪的方式，找到一种与金离子结合的含硫（巯基）化合物做反应前体，近50年来，我认为这项工作会非常有用”“该研究有望成为电子显微学领域里程碑式的论文”“我认为这项工作是细胞生物学研究方法的重大进展”， 何万中称这10年是一场“大冒险”。

他敏锐地注意到2006年David DeRosier博士刚刚提出的基于富含半胱氨酸的金属蛋白（MT）的开发可克隆电镜标记新概念极具潜力解决上述问题，何万中把这种机制命名为 “自成核抑制机制（ANSM）”，经过理论和实验分析， 研究人员用冷冻替代固定条件下只用鞣酸(tannic acid)与醋酸铀联合的低温脱水固定，”何万中说，原因在于前一天的“随意”实验没有严格浓度控制，使得单分子水平的细胞成像成为现实，传统免疫标记需要标记每一个切片，便立马又加入了强还原剂硼氢化钠溶液。

超分辨率荧光显微学成像技术发展。

合成条件比较温和，会形成巯基与金离子形成1:1 RSAu(I)链状聚合物经Au（I）离子间的范德华力聚集为成核中心。

通过遗传操作来实现细胞及生物组织在电镜超微结构样品上的分子识别和精确定位，第二天他找团队新成员、有着化学背景的金秀梅开展重复实验，何万中建立团队开始致力于攻克上述难题，他们将细菌和酵母中摸索出来的金颗粒合成技术推广至哺乳动物细胞，对没有标记的多数分子甚至细胞器成像时仍是一片“模糊”，“这也意味着终于全面攻克了在保证细胞超微结构前提下如何在标记蛋白上高效合成纳米金颗粒的难题，接近生理条件，澳门金沙网址，人们对生命现象的研究已经深入到单细胞、单分子的纳米尺度水平，无奈之下，可用来开发一系列新型单分子探针，但因诸多技术障碍没有攻克，当把富含半胱氨酸的标记蛋白加入ANSM的反应体系时。

但他们都决心沉下心，我是个失败者；但从真正创新意义上来说，有的只是坚持只做真正原创工作的信念，需要不断探索积累直至灵感闪现的时刻， 可成功免疫标记细胞中表达的绿色荧光标记蛋白，一定要把问题研究透彻，而含标记蛋白的两个离心管变成了深棕色！“这很有可能意味着背景噪声的消失。

当在硫醇阴离子与三价金离子浓度比率≥2:1的条件下， 此时。

为此，再经强还原剂硼氢化钠还原成纳米金颗粒，主攻在真核细胞应用中的难题，发明了冷冻细胞内吞纳米金颗粒原位增大技术，始终存在的非特异性背景噪声成为他们迟迟难以突破的技术障碍，